Wymagany stopień czystości białka zależy od zamierzonego końcowego zastosowania białka.
Dla niektórych zastosowań wystarczający jest surowy ekstrakt. Jednak w przypadku innych zastosowań, np. W żywności i środkach farmaceutycznych, wymagany jest wysoki poziom czystości. Aby to osiągnąć, zwykle stosuje się szereg metod oczyszczania białek w serii etapów oczyszczania.
Każdy etap oczyszczania białka zwykle powoduje pewien stopień utraty produktu. Dlatego idealna strategia oczyszczania białka to taka, w której najwyższy poziom oczyszczenia osiąga się w najmniejszej liczbie etapów. Wybór, które etapy zastosować, zależy od wielkości, ładunku, rozpuszczalności i innych właściwości docelowego białka. Następujące techniki są najbardziej odpowiednie do oczyszczenia pojedynczego białka cytosolowego. Oczyszczanie cytosolikowych kompleksów białkowych jest bardziej skomplikowane i zwykle wymaga zastosowania różnych metod.
Pierwsze kroki do oczyszczenia białka
Pierwszym krokiem w oczyszczaniu wewnątrzkomórkowych (wewnątrz komórki) białek jest przygotowanie surowego ekstraktu .
Ekstrakt będzie zawierał złożoną mieszaninę wszystkich białek z cytoplazmy komórkowej oraz kilka dodatkowych makrocząsteczek, kofaktorów i składników odżywczych. Surowy ekstrakt może być wykorzystywany do niektórych zastosowań w biotechnologii, jednak jeśli czystość jest problemem, należy postępować zgodnie z kolejnymi etapami oczyszczania.
Surowe ekstrakty białkowe wytwarza się przez usuwanie resztek komórkowych generowanych przez lizę komórek, co osiąga się stosując chemikalia i enzymy , sonikację lub French Press. Pozostałości usuwa się przez odwirowanie i odzyskuje się supernatant. Surowe preparaty białek pozakomórkowych można uzyskać przez proste usunięcie komórek przez odwirowanie.
W przypadku niektórych zastosowań biotechnologicznych istnieje zapotrzebowanie na enzymy termostabilne : Enzymy, które mogą tolerować wysokie temperatury bez denaturacji i przy zachowaniu wysokiej specyficznej aktywności. Organizmy, które je produkują, są czasami nazywane ekstremofilami. Łatwe podejście do oczyszczania odpornego na ciepło białka polega na denaturacji innych białek w mieszaninie przez ogrzewanie, a następnie schłodzenie roztworu (co pozwala termostabilnemu enzymowi na zreformowanie lub ponowne rozpuszczenie, jeśli jest to konieczne.Zd zdenaturowane białka można następnie usunąć przez odwirowanie.
Pośrednie etapy oczyszczania
W przeszłości wspólnym drugim etapem oczyszczania białka z surowego ekstraktu było wytrącanie w roztworze o wysokiej mocy osmotycznej (tj. Roztwory soli). Kwasy nukleinowe w surowym ekstrakcie można usunąć przez wytrącenie agregatów utworzonych z siarczanu streptomycyny lub siarczanu protaminy.
Wytrącanie białek zwykle przeprowadza się przy użyciu siarczanu amonu jako soli.
Różne białka będą się wytrącały w różnych stężeniach siarczanu amonu . Ogólnie, białka o wyższej masie cząsteczkowej wytrącają się w niższych stężeniach siarczanu amonu. Wydzielanie soli zazwyczaj nie prowadzi do wysoce oczyszczonego białka, ale może pomóc w wyeliminowaniu niepożądanych białek w mieszaninie i zatężeniu próbki. Sole w roztworze są następnie usuwane przez dializę przez porowatą rurkę celulozową, filtrację lub chromatografię żelową.
Nowoczesne protokoły biotechnologiczne często wykorzystują wiele dostępnych na rynku zestawów, które zapewniają gotowe rozwiązania dla standardowych procedur. Oczyszczanie białka często przeprowadza się przy użyciu filtrów i przygotowanych kolumn do filtracji żelowej. Wystarczy postępować zgodnie z instrukcjami i dodać właściwą objętość odpowiedniego roztworu i odczekać określony czas, zbierając eluent (co wychodzi z drugiego końca kolumny) w świeżej probówce.
- Metody chromatograficzne mogą być stosowane za pomocą kolumn typu bench-top lub zautomatyzowanych urządzeń HPLC. Rozdzielanie za pomocą HPLC można przeprowadzić za pomocą metod z odwróconą fazą, wymianą jonową lub metodą wykluczania wielkości, a próbki są wykrywane przez układ diodowy lub technologię laserową. Wcześniejsze
Wizualizacja białka i ocena oczyszczenia
- Chromatografia w odwróconym układzie faz (RPC) oddziela białka w oparciu o ich względną hydrofobowość . Ta technika jest wysoce selektywna, ale wymaga użycia rozpuszczalników organicznych. Niektóre białka są trwale denaturowane przez rozpuszczalniki i tracą funkcjonalność podczas RPC. Dlatego ta metoda nie jest zalecana do wszystkich zastosowań, szczególnie jeśli zachodzi potrzeba, aby docelowe białko zachowało aktywność.
- Chromatografia jonowymienna odnosi się do rozdziału białek w oparciu o ładunek . Kolumny mogą być przygotowane do wymiany anionów lub wymiany kationów. Kolumny anionowymienne zawierają fazę stacjonarną z dodatnim ładunkiem, który przyciąga ujemnie naładowane białka. Kationowymienne kolumny są odwrotnymi ujemnie naładowanymi kulkami, które przyciągają dodatnio naładowane białka. Wymywanie docelowego białka (białek) dokonuje się przez zmianę pH w kolumnie, co powoduje zmianę lub neutralizację naładowanych grup funkcyjnych każdego białka.
- Chromatografia wykluczania ( filtracja żelowa ) oddziela większe białka od małych, ponieważ większe cząsteczki przemieszczają się szybciej przez usieciowany polimer w kolumnie chromatograficznej. Duże białka nie pasują do porów polimeru, podczas gdy mniejsze białka i podróżują przez kolumnę chromatograficzną przez ich mniej bezpośrednią drogę. Eluat zbiera się w serii probówek oddzielających białka w oparciu o czas eluowania. Filtracja żelowa jest użytecznym narzędziem do zatężania próbki białka, ponieważ docelowe białko zbiera się w mniejszej objętości elucji niż początkowo dodano do kolumny. Podobne techniki filtracji mogą być stosowane podczas produkcji białek na dużą skalę ze względu na ich opłacalność.
- Chromatografia powinowactwa jest bardzo przydatną techniką do "polerowania" lub dokończenia procesu oczyszczania białka. Kulki w kolumnie chromatograficznej są usieciowane z ligandami, które wiążą się swoiście z docelowym białkiem. Białko następnie usuwa się z kolumny przez płukanie roztworem zawierającym wolne ligandy. Ta metoda daje najczystsze wyniki i najwyższą aktywność właściwą w porównaniu z innymi technikami.
- SDS-PAGE to elektroforeza w żelu poliakryloamidowym, wykonywana w obecności SDS (dodecylosiarczanu sodu), która wiąże się z białkami, dając im duży ujemny ładunek netto. Ponieważ ładunki wszystkich białek są dość równe, metoda ta rozdziela je niemal w całości na podstawie wielkości. SDS-PAGE jest często używany do testowania czystości białka po każdym etapie serii. Ponieważ niechciane białka są stopniowo usuwane z mieszaniny, liczba pasm wizualizowanych na żelu SDS-PAGE jest zmniejszona, aż do uzyskania tylko jednego pasma reprezentującego pożądane białko.
- Immunoblotting to technika wizualizacji białek stosowana w połączeniu z chromatografią powinowactwa. Przeciwciała dla określonego białka są stosowane jako ligandy na kolumnie chromatograficznej powinowactwa. Docelowe białko zatrzymuje się na kolumnie, a następnie usuwa przez przepłukanie kolumny roztworem soli lub innymi środkami. Przeciwciała związane z etykietami radioaktywnymi lub barwnikami pomagają w wykryciu docelowego białka po oddzieleniu go od reszty mieszaniny.
Źródła:
Zubay G. 1988. Biochemistry, wydanie 2. Macmillan Publishing Co., Nowy Jork, NY, USA.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Protein Purification Handbook, Edition AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, USA. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.