Korekty dowolnego składnika reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) mogą wpłynąć na jakość wyniku, albo poprzez polepszenie lub zmniejszenie wydajności i jakości produktu, albo przez poprawę specyficzności i wrażliwości reakcji. Parametry, które wpływają na wynik końcowy, mogą być fizyczne (tj. Temperatura, czasy cyklu) lub chemiczne (tj. Stężenie matrycy, typ zastosowanego enzymu). Poniżej przedstawiono kilka kluczowych czynników, które mają wpływ na powodzenie PCR.
01 Czyste warunki laboratoryjne
Ponieważ PCR jest zdolny do wykrywania pojedynczej cząsteczki DNA, ważne jest utrzymanie w laboratorium nieskazitelnych warunków. Zawsze zakładaj nowe rękawiczki, używaj sterylnych naczyń szklanych, probówek i końcówek do pipet oraz sterylnych roztworów i oczyść miejsce pracy przed rozpoczęciem pracy.
Zawsze włączaj reakcje kontrolne, bez matrycowego DNA i bez enzymu, aby zapewnić, że wyniki są naprawdę wynikiem amplifikacji właściwej próbki.
Większość ludzi musi mieć własny zestaw rozwiązań, które nie są udostępniane, aby ułatwić rozwiązywanie problemów, a wyznaczone pipety są często zarezerwowane tylko dla PCR. Probówki do PCR z DNazą i RNazą, końcówki do pipet odpornych na działanie aerozoli i działające w wyciągu z promieniowaniem UV to również sposoby na zminimalizowanie problemów.
02 Składniki chemiczne
- Ma 18 do 24 zasad
- Nie mają struktury drugorzędnej (tj. Pętli spinki do włosów)
- Mają zrównoważoną dystrybucję par G / C i A / T
- Nie są ze sobą komplementarne na końcach 3 stóp
- Mieć temperaturę topnienia (Tm) około 5-10 stopni Celsjusza poniżej temperatury wyżarzania, która zwykle wynosi od 55 do 65 stopni Celsjusza
Tm dla obu starterów również powinno być podobne dla uzyskania najlepszych rezultatów.
03 Mix mieszaniny reakcyjnej: szablon i podkłady
Optymalne stężenia starterów wynoszą od 0,1 do 0,6 mikromoli / litr. Ilość matrycy zmienia się w zależności od rodzaju DNA (ludzkiego, bakteryjnego, plazmidowego).
Przy bardzo małych ilościach szablonów istnieją inne strategie poprawy wyników, takie jak zwiększenie liczby cykli lub użycie "gorącego startu". Zawsze testuj nowe startery z pozytywną reakcją kontrolną, aby mieć pewność, że działają one w określonych warunkach eksperymentalnych.
04 Mieszanka reakcyjna: aktywność enzymu
Stężenie MgCl2 w mieszaninie reakcyjnej może wpływać na wynik PCR i może odgrywać ważną rolę w bardziej wymagających reakcjach. Kation magnezowy tworzy rozpuszczalne kompleksy z dNTP w celu wytworzenia właściwego substratu, który rozpoznaje enzym polimerazy.
Równe ilości wszystkich czterech dNTP również pomagają zmniejszyć współczynnik błędu polimerazy. Niektóre dodatki, takie jak betaina, BSA, detergenty, DMSO, glicerol i pirofosfatazy, mogą również wpływać na swoistość enzymu lub wydajność reakcji.
05 Typ Thermocycler
Robiąc zakupy na sprzęty laboratoryjne, pamiętaj, że niektóre termocyklery są mniej precyzyjne niż inne przy zachowaniu dokładnych, pożądanych temperatur.
Jest to dziedzina, w której taniej nie opłaca się na dłuższą metę, gdy czeka cię drobna reakcja lub stosowanie gruntów wymagających wąskiego zakresu temperatur wyżarzania.
Cienkościenne rury reakcyjne zaprojektowane tak, aby pasowały do precyzyjnej marki używanego termocyklera, pomagają również optymalizować temperaturę reakcji.
06 Ustawienia cyklu
Zwiększenie wydajności można uzyskać przez wydłużenie czasu rozciągania około co 20 cykli, aby zrekompensować mniej enzymu w celu wzmocnienia większej ilości matrycy. Zwykle wystarcza mniej niż 40 cykli do powielenia mniej niż 10 cząsteczek matrycy do stężenia wystarczająco dużego, aby zobaczyć na żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny.