Opracowany w 1983 r. Proces PCR umożliwił sekwencjonowanie DNA i określenie kolejności nukleotydów w poszczególnych genach.
Metoda wykorzystuje cykl termiczny lub wielokrotne ogrzewanie i chłodzenie reakcji do topienia i replikacji DNA. W miarę kontynuowania reakcji PCR, "nowy" DNA jest stosowany jako matryca do replikacji i następuje reakcja łańcuchowa, wykładniczo wzmacniająca matrycę DNA.
Techniki PCR są stosowane w wielu dziedzinach biotechnologii, w tym w inżynierii białek , klonowaniu, kryminalistyce (odciski palców DNA), testach na ojcostwo, diagnozowaniu dziedzicznych i / lub zakaźnych chorób oraz w analizie próbek środowiskowych.
W szczególności w medycynie sądowej PCR jest szczególnie przydatny, ponieważ wzmacnia nawet najmniejszą ilość dowodów DNA. PCR może być również wykorzystany do analizy DNA, który ma tysiące lat i te techniki zostały wykorzystane do identyfikacji wszystkiego, od mamuta liczącego 800 000 lat do mumii z całego świata.
Procedura PCR jest następująca:
- Inicjalizacja: Ten etap jest konieczny tylko dla polimerazy DNA, które wymagają PCR z gorącym startem. Mieszaninę reakcyjną ogrzewa się do temperatury od 94 do 96 ° C i utrzymuje w ciągu 1-9 minut.
- Denaturacja: jeśli procedura nie wymaga inicjalizacji, denaturacja jest pierwszym krokiem. Mieszaninę reakcyjną ogrzewa się do 94-98 ° C przez 20-30 sekund. Wiązania wodorowe matrycy DNA zostają rozerwane i powstają jednoniciowe cząsteczki DNA.
- Wyżarzanie: Temperatura reakcji jest niższa od 50 do 65 ° C i utrzymywana przez 20-40 sekund. Startery hybrydyzują z jednoniciowym szablonem DNA. Temperatura jest niezwykle ważna podczas tego etapu. Jeśli jest zbyt gorąco, podkład może się nie związać. Jeśli jest zbyt zimno, podkład może się niedokładnie związać. Dobre wiązanie powstaje, gdy sekwencja startera ściśle pasuje do sekwencji matrycy.
- Przedłużenie / Wydłużenie: Temperatura podczas tego etapu zmienia się w zależności od rodzaju polimerazy. Polimeraza DNA syntetyzuje całkowicie nową nić DNA.
- Końcowe wydłużenie: Ten etap przeprowadza się w temperaturze 70-74 ° C przez 5-15 minut po ostatnim cyklu PCR.
- Ostateczne wstrzymanie: ten krok jest opcjonalny. Temperaturę utrzymuje się w temperaturze 4-15 ° C i poddaje reakcji.
Procedura jest podzielona na trzy etapy:
- Wykładnicza amplifikacja: Podczas każdego cyklu produkt (specyficzny fragment DNA, który jest replikowany) jest podwojony.
- Stopień wyrównywania: Ponieważ polimeraza DNA traci aktywność i zużywa odczynniki, reakcja ulega spowolnieniu.
- Płaskowyż: nie gromadzi się żaden produkt.