Sekwencjonowanie DNA zależy również od naszej zdolności do elektroforezy żelowej w celu oddzielenia pasm DNA różniących się wielkością o zaledwie jedną parę zasad.
Sekwencjonowanie DNA
Pod koniec lat siedemdziesiątych wynaleziono dwie techniki sekwencjonowania DNA dla dłuższych cząsteczek DNA. Były to metody Sanger (lub didexy) i metoda Maxam-Gilbert (chemiczne cięcie). Metoda Maxama-Gilberta oparta jest na cięciu specyficznym dla nukleotydów za pomocą substancji chemicznych i najlepiej jest stosować ją do sekwencjonowania oligonukleotydów (krótkie polimery nukleotydowe, zwykle mniejsze niż 50 par zasad). Metoda Sangera jest częściej używana, ponieważ została udowodniona technicznie łatwiejsza do zastosowania, a wraz z pojawieniem się PCR i automatyzacji techniki, jest łatwo stosowana do długich pasm DNA, w tym niektórych całych genów. Technika ta opiera się na zakończeniu łańcucha przez dideoksynukleotydy podczas reakcji wydłużania PCR.
Metoda Sanger
W metodzie Sangera nić DNA, która ma być analizowana, jest wykorzystywana jako matryca, a polimeraza DNA jest stosowana w reakcji PCR do generowania wolnych pasm przy użyciu starterów.
Przygotowuje się cztery różne mieszaniny reakcyjne PCR, z których każda zawiera pewien procent analogów trifosforanu dideoksynukleozydu (ddNTP) z jednym z czterech nukleotydów (ATP, CTP, GTP lub TTP). Synteza nowej nici DNA trwa aż do włączenia jednego z tych analogów, w którym to czasie nić zostaje przedwcześnie obcięta.
Każda reakcja PCR zakończy się zawierając mieszaninę różnych długości nici DNA, wszystkie zakończone nukleotydem, który był oznaczony dideoksy dla tej reakcji. Elektroforeza żelowa jest następnie wykorzystywana do rozdzielenia pasm czterech reakcji, w czterech oddzielnych ścieżkach i określenia sekwencji oryginalnego szablonu w oparciu o to, jakie długości nici kończą się tym, co nukleotydem.
W zautomatyzowanej reakcji Sangera stosowane są startery oznaczone czterema różnymi kolorowymi znacznikami fluorescencyjnymi. Reakcje PCR w obecności różnych nukleotydów dideoksy przeprowadza się w sposób opisany powyżej. Następnie, następnie cztery mieszaniny reakcyjne są następnie łączone i nakładane na pojedynczą ścieżkę żelu. Kolor każdego fragmentu jest wykrywany za pomocą wiązki laserowej, a informacja jest zbierana przez komputer, który generuje chromatogramy pokazujące piki dla każdego koloru, z których można ustalić sekwencję DNA matrycy.
Zazwyczaj zautomatyzowana metoda sekwencjonowania jest dokładna tylko dla sekwencji o maksymalnej długości około 700-800 par zasad. Jednak możliwe jest uzyskanie pełnej sekwencji większych genów i, w rzeczywistości, całych genomów, przy użyciu metod etapowych, takich jak sekwencjonowanie Primer i Shotgun.
W Primer Walking , wykonalna część większego genu jest sekwencjonowana za pomocą metody Sangera. Nowe startery są generowane z wiarygodnego segmentu sekwencji i wykorzystywane do kontynuowania sekwencjonowania części genu, który był poza zakresem pierwotnych reakcji.
Sekwencjonowanie metodą shotgun polega na losowym wycinaniu interesującego segmentu DNA na bardziej odpowiednie (możliwe do zarządzania) fragmenty, sekwencjonowanie każdego fragmentu i układanie kawałków w oparciu o zachodzące na siebie sekwencje. Technika ta została uproszczona dzięki zastosowaniu oprogramowania komputerowego do układania zachodzących na siebie elementów.