Co PCR ma wspólnego z sekwencjonowaniem DNA i genami wzmacniającymi
Łańcuchowa reakcja polimerazy ( PCR ) jest genetyczną techniką molekularną do tworzenia wielu kopii genu i jest również częścią procesu sekwencjonowania genu.
Jak działa reakcja łańcuchowa polimerazy?
Kopie genów są wykonywane przy użyciu próbki DNA, a technologia jest wystarczająco dobra, aby utworzyć wiele kopii z jednej kopii genu znalezionego w próbce. Amplifikacja PCR genu w celu uzyskania milionów kopii, umożliwia wykrycie i identyfikację sekwencji genów za pomocą technik wizualnych opartych na rozmiarze i ładunku (+ lub -) fragmentu DNA.
W kontrolowanych warunkach małe segmenty DNA są generowane przez enzymy znane jako polimerazy DNA, które dodają bezpłatne deoksynukleotydy (dNTP) do kawałka DNA znanego jako "szablon". Nawet mniejsze fragmenty DNA, zwane "starterami" są stosowane jako punkt wyjścia dla polimerazy. Startery są drobnocząsteczkowymi fragmentami DNA (oligomerami), zwykle o długości od 15 do 30 nukleotydów. Są one wytwarzane przez poznanie lub zgadywanie krótkich sekwencji DNA na samych końcach amplifikowanego genu. Podczas PCR, sekwencjonowany DNA jest podgrzewany, a podwójne nici rozdzielane. Po ochłodzeniu startery wiążą się z matrycą (zwaną hybrydyzacją) i tworzą miejsce dla polimerazy.
Technika PCR
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) stała się możliwa dzięki odkryciu termofili i termofilnych enzymów polimerazy (enzymów, które zachowują integralność strukturalną i funkcjonalność po ogrzewaniu w wysokich temperaturach).
Etapy związane z techniką PCR są następujące:
- Powstaje mieszanina o zoptymalizowanych stężeniach matrycy DNA, enzymu polimerazy, starterów i dNTP. Zdolność do ogrzania mieszaniny bez denaturacji enzymu pozwala na denaturację podwójnej helisy próbki DNA w temperaturach w zakresie 94 stopni Celsjusza.
- Po denaturacji próbka jest schładzana do bardziej umiarkowanego zakresu, około 54 stopni, co ułatwia hybrydyzację (wiązanie) starterów z jednoniciowymi matrycami DNA.
- W trzecim etapie cyklu próbkę ponownie ogrzewa się do 72 stopni, idealnej temperatury dla polimerazy DNA Taq, w celu wydłużenia. Podczas wydłużania, polimeraza DNA wykorzystuje oryginalną pojedynczą nić DNA jako matrycę do dodania komplementarnych dNTP do końców 3 'każdego startera i generuje odcinek dwuniciowego DNA w regionie genu będącego przedmiotem zainteresowania.
- Startery, które wyhodowały sekwencje DNA, które nie są dokładnie dopasowane, nie zostają wygrzewane w temperaturze 72 stopni, co ogranicza wydłużenie do genu będącego przedmiotem zainteresowania.
Ten proces denaturowania, hybrydyzacji i wydłużania powtarza się wielokrotnie (30-40) razy, zwiększając w ten sposób wykładniczo liczbę kopii pożądanego genu w mieszaninie. Chociaż proces ten byłby dość męczący, gdyby był wykonywany ręcznie, próbki można przygotować i inkubować w programowalnym termocyklerze, obecnie powszechnym w większości laboratoriów molekularnych, a pełną reakcję PCR można przeprowadzić w ciągu 3-4 godzin.
Każdy etap denaturacji zatrzymuje proces wydłużania poprzedniego cyklu, w ten sposób skracając nową nić DNA i utrzymując ją w przybliżeniu w wielkości pożądanego genu.
Czas trwania cyklu wydłużania można wydłużyć lub wydłużyć w zależności od wielkości interesującego genu, ale ostatecznie, poprzez wielokrotne cykle PCR, większość matryc będzie ograniczona do wielkości samego genu, ponieważ zostaną wygenerowane z produktów obu primerów.
Istnieje wiele różnych czynników, które można wykorzystać do skutecznej reakcji PCR, które można modyfikować w celu poprawy wyników. Najszerzej stosowaną metodą do testowania obecności produktu PCR jest elektroforeza w żelu agarozowym . Który służy do oddzielania fragmentów DNA w oparciu o rozmiar i ładunek. Fragmenty wizualizuje się następnie za pomocą barwników lub radioizotopów.
Ewolucja
Od czasu odkrycia PCR odkryto polimerazy DNA inne niż oryginalny Taq. Niektóre z nich mają lepszą zdolność "korekty" lub są bardziej stabilne w wyższych temperaturach, poprawiając w ten sposób specyficzność PCR i redukując błędy wynikające z wstawienia nieprawidłowego dNTP.
Niektóre odmiany PCR zostały zaprojektowane do konkretnych zastosowań i są obecnie regularnie stosowane w laboratoriach genetycznych. Niektóre z nich to Real-Time PCR i PCR z odwrotną transkryptazą. Odkrycie PCR doprowadziło również do opracowania sekwencjonowania DNA, pobierania odcisków palców DNA i innych technik molekularnych.