Klonowanie genów jest aktem tworzenia kopii lub klonów pojedynczego genu. Po zidentyfikowaniu genu klony mogą być wykorzystywane w wielu dziedzinach badań biomedycznych i przemysłowych. Inżynieria genetyczna to proces klonowania genów do nowych organizmów lub zmiany sekwencji DNA w celu zmiany produktu białkowego. Inżynieria genetyczna zależy od naszej zdolności do wykonywania następujących podstawowych procedur.
Reakcja łańcuchowa polimerazy
02 Enzymy restrykcyjne
Odkrycie enzymów znanych jako endonukleazy restrykcyjne było kluczowe dla inżynierii białek . Enzymy te wycinają DNA w określonych miejscach w oparciu o sekwencję nukleotydową. Setki różnych enzymów restrykcyjnych , zdolnych do cięcia DNA w odrębnym miejscu, zostały wyizolowane z wielu różnych szczepów bakterii. DNA cięte enzymem restrykcyjnym wytwarza wiele mniejszych fragmentów o różnych rozmiarach. Można je rozdzielić za pomocą elektroforezy żelowej lub chromatografii.
03 Elektroforeza
Oczyszczanie DNA z hodowli komórkowej lub wycinanie go przy użyciu enzymów restrykcyjnych nie byłoby zbyt przydatne, gdybyśmy nie mogli zwizualizować DNA - to znaczy znaleźć sposób na sprawdzenie, czy twój ekstrakt zawiera cokolwiek, czy też jaki rozmiar cię dzieli. Wycięłem to. Jednym ze sposobów jest elektroforeza żelowa. Żele są wykorzystywane do różnych celów, od oglądania ciętego DNA do wykrywania wstawek DNA i nokautów.
04 Połącz dwa kawałki DNA
W badaniach genetycznych często konieczne jest połączenie dwóch lub więcej pojedynczych nici DNA, aby utworzyć zrekombinowaną nić lub zamknąć okrągłą nić, która została pocięta enzymami restrykcyjnymi. Enzymy zwane ligazami DNA mogą tworzyć kowalencyjne wiązania między łańcuchami nukleotydowymi. Enzymy polimeraza DNA I i kinaza polinukleotydowa są również ważne w tym procesie, odpowiednio do wypełniania luk lub fosforylowania końców 5 '.
05 Wybór małego, samo-replikującego się DNA
Małe okrągłe fragmenty DNA, które nie są częścią genomu bakterii, ale są zdolne do autoreplikacji, są znane jako plazmidy. Plazmidy są często używane jako wektory do transportu genów między mikroorganizmami. W biotechnologii, gdy gen będący przedmiotem zainteresowania został zamplifikowany, a zarówno gen, jak i plazmid są cięte przez enzymy restrykcyjne, są one razem poddawane ligacji, wytwarzając tak zwany rekombinowany DNA. Jako wektor można również użyć DNA wirusowego (bakteriofaga), podobnie jak kosmidy, rekombinowane plazmidy zawierające geny bakteriofagów.
06 Metoda przenoszenia wektora do komórki gospodarza
Proces przenoszenia materiału genetycznego na wektor, taki jak plazmid, do nowych komórek gospodarza, nazywany jest transformacją. Ta technika wymaga, aby komórki gospodarza były narażone na zmiany środowiskowe, co czyni je "kompetentnymi" lub czasowo przepuszczalnymi dla wektora. Elektroporacja jest jedną z takich technik. Im większy plazmid, tym niższa skuteczność, z jaką jest on pobierany przez komórki. Większe segmenty DNA można łatwiej klonować przy użyciu bakteriofaga, retrowirusa lub innych wektorów wirusowych lub kosmidów w metodzie nazywanej transdukcją. Wektory do fagów lub wirusów są często stosowane w medycynie regeneracyjnej, ale mogą powodować wnikanie DNA w części naszych chromosomów tam, gdzie tego nie chcemy, powodując powikłania, a nawet raka.
07 Metody wybierania organizmów transgenicznych
Nie wszystkie komórki zajmą DNA podczas transformacji. Istotne jest, aby istniała metoda wykrywania tych, które robią. Ogólnie rzecz biorąc, plazmidy niosą geny dla oporności na antybiotyki, a komórki transgeniczne można wybierać w oparciu o ekspresję tych genów i ich zdolność do wzrostu na pożywkach zawierających ten antybiotyk. Alternatywne metody selekcji zależą od obecności innych białek reporterowych, takich jak układ x-gal / lacZ lub zielone białko fluorescencyjne, które umożliwiają selekcję odpowiednio w oparciu o kolor i fluorescencję.